Разработка методики количественного определения ритонавира и лопинавира в плазме крови

Abstract

Therapeutic monitoring of antiretroviral drugs (ARVs) is necessary in routine practice, both to objectively monitor adherence and to ensure a personalized approach to patient treatment. Most methods of quantitative determination of ARVP, in particular, ritonavir and lopinavir, are carried out using high-performance liquid chromatography with a tandem mass-selective detector (HPLC-MS/MS) or in combination with UV detection (HPLC-UV), with a single quadrupole detector (HPLC-MS). However, these methods provided for the use of a large range of expensive solvents of a high degree of purification, a long time of analysis and sample preparation, which prevented the introduction of these methods into routine practice. The aim of the study to evaluate the effectiveness of the developed technique for quantifying the concentration of Ritonavir and Lopinavir in blood plasma by HPLC-UV. Materials and methods. The following drugs were used in the study: Ritonavir and Lopinavir. Efavirenz was used for the internal standard. Randomly selected blood samples with anticoagulant from patients who did not take antiretroviral drugs were used as test samples. Chromatographic separation and detection were performed by HPLC-UV. The chromatographic separation process was controlled and the chromatographic analysis results were processed using the OpenLab CDS Chromatographic Data System software. The calibration curves were calculated using a linear regression mathematical model based on the least square’s method. Statistical data processing was carried out using the software product “Statistica v.12” (StatSoft Russia). Results The linear range of plasma concentration determination was 1-50 µg/ml for Ritonavir and 2-100 µg/ml for Lopinavir. Due to the short retention time – less than 7 minutes, the technique allows you to examine up to 7.5 samples per hour on one device. Discussion Most of the methods of quantitative determination of Ritonavir and Lopinavir for therapeutic monitoring of ART are carried out using HPLC-MS/MS or HPLC-UV, however, all of them provided for the use of a large range of expensive solvents of a high degree of purification, a long time of analysis and sample preparation, which prevented the introduction of these methods into routine practice. Conclusion The developed technique for quantifying the concentration of Ritonavir and Lopinavir in blood plasma using high-performance liquid chromatography with an ultraviolet detector (HPLC-UV) has a sufficiently wide linear range of concentration determination and high performance for further validation and implementation into clinical practice.

Терапевтический мониторинг антиретровирусных препаратов (АРВП) необходим в рутинной практике, как для объективного контроля приверженности, так и для обеспечения персонализированного подхода к лечению пациентов. Большинство методик количественного определения АРВП, в частности, Ритонавира и Лопинавира, проводятся с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-селективным детектором (ВЭЖХ-МС/МС) или моноквадрупольным детектором (ВЭЖХ-МС). Однако перечисленные методики предусматривали использование большого спектра дорогостоящих растворителей высокой чистоты и очень чувствительны к буферам, что ограничивает их применение. Цель работы – разработать методику количественного определения концентрации Ритонавира и Лопинавира в плазме крови методом ВЭЖХ-УФ, оптимальной для рутинной практики, а также установить линейные диапазоны определяемых концентраций. Материалы и методы. В исследовании были использованы лекарственные средства: Ритонавир и Лопинавир. Для внутреннего стандарта использовалось лекарственное средство Эфавиренз. В качестве тестовых образцов использовали случайно отобранные пробы крови с антикоагулянтом от пациентов, не принимавших антиретровирусные препараты. Анализ проводили методом ВЭЖХ-УФ на приборе Agilent 1260 Infinity с диодно-матричным детектором, используя программное обеспечение OpenLab CDS. Расчёт калибровочных кривых производился с помощью математической модели линейной регрессии, построенной на основе метода наименьших квадратов. Статистическую обработку данных проводили с помощью программного продукта «Statistica v.12» (StatSoft Russia). Результаты. Линейный диапазон определения концентрации в плазме крови составил для Ритонавира 1-50 мкг/мл, для Лопинавира 2-100 мкг/мл (R2>0,999). За счёт короткого времени удержания – менее 7 минут, методика позволяет исследовать до 7,5 образцов в час на одном приборе. Обсуждение. Большинство методик количественного определения Ритонавира и Лопинавира для терапевтического мониторинга АРТ проводятся с использованием ВЭЖХ-МС/МС или ВЭЖХ-УФ, однако все они предусматривали использование большого спектра дорогостоящих растворителей высокой степени очистки, длительное время анализа и пробоподготовки, что препятствовало внедрению этих методов в рутинную практику. Заключение. Разработанная методика количественного определения концентрации Ритонавира и Лопинавира в плазме крови с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии с ультрафиолетовым детектором (ВЭЖХ-УФ) обладает достаточно широким линейным диапазоном определения концентраций с линейной аппроксимацией измерений, точно характеризующей концентрацию препаратов, и высокой производительностью для дальнейшей валидации и внедрения в клиническую практику.