Приготовление гистологического препарата из костного мозга трубчатых костей

Abstract

In morphological studies, one of the main methods of obtaining information is the histological method as the most known and accurate. Preparation of histological preparations from liquid biological objects is a rather complex and time-consuming process. We faced with the need to prepare histological preparations from the bone marrow of tubular bones and therefore set the purpose. The aim of the study: to develop a simplified modification of obtaining histological sections of bone marrow. Materials and methods: tubular bone marrow, 10% colorless food gelatin, 10% neutral formalin, histological dyes (hematoxylin-eosin), immunohistochemistry: CD34 (cat. 550390, Clone 581, 1:10, Becton Dickinson (USA)), Retrievagen a (pH 6.0) (cat. 550524, Becton Dickinson (USA)), Antibody Diluent for IHC (cat. 559148, Becton Dickinson (USA), Anti-Mouse Ig HRP Detection Kit (cat. 551011, Becton Dickinson (USA). Bring 10% gelatin to a liquid state over low heat. The resulting solution placed in a heat-insulating dish. The bone marrow combined with dissolved gelatin in a ratio of 1:1. In the resulting mixture is added 10% formalin in a ratio of 1: 10 and mix gently. Thus, the concentration of formalin in the mixture of bone marrow and gelatin reaches about 0.8-1.0%. Everything placed in a refrigerator at 2-4 t to harden for 30-60 min. From the obtained hardened material cut in blocks from which on the freezing microtome sections obtained with thickness of 4-6 microns. The sections placed on glass slides treated with polylysin (Thermo Scientific). Hematoxylin – eosin staining performed for histological examination. Immunohistochemical study the sections were processed Retrievagen A (pH 6.0) (cat. 550524, Becton Dickinson (USA)) to unmask the antigen according to the manufacturer's Protocol. CD34 antibodies divorced Antibody Diluent for IHC (cat. 559148, Becton Dickinson (USA) at a ratio of 1: 10 and applied to the slices according to the instructions manufacturer's. Then the slices processed by the visualization system with detection of DUB Anti-Mouse Ig HRP Detection Kit (cat. 551011, Becton Dickinson (USA), painted with hematoxylin and covered with cover glass. Further histological preparations visualized on an optical microscope Olympus CX 41 (Japan). Results: reduced preparation time of histological blocks and sections; preserved lifetime fixation state of cells and tissues, through use of 0.5% formalin. Excluded more expensive products (paraffin, celloidin, special paraffin for histological examination, containing different plastic polymers) and other consumables when posting blocks and slices; the modification allows you to prepare no less quality histological specimens obtained by other methods. Conclusion: this modification of obtaining histological sections of liquid biological objects has a number of advantages and can used in scientific research, as well as in histological and pathohistological practice.

Изучение костного мозга является важной частью в прогнозировании терапевтического эффекта лечения клеточными продуктами. При морфологических исследованиях одним из основных методов получения информации является гистологический метод как наиболее известный и точный. Прижизненное получение костного мозга является достаточно сложным и трудоемким процессом. Мы столкнулись с необходимостью приготовления гистологических препаратов из костного мозга трубчатых костей и вследствие этого поставили цель: оптимизировать способ получения гистологических срезов костного мозга трубчатых костей. Материалы и методы: костный мозг трубчатой кости (бедренная кость), 10% бесцветный пищевой желатин, 10% нейтральный формалин, гистологические красители (гематоксилин-эозин), иммуногистохимия: CD34 (кат. 550390, Clone 581, 1:10, BectonDickinson (США)), Retrievagen A (pH 6.0) (кат. 550524, BectonDickinson (США)), AntibodyDiluentfor IHC (кат. 559148, BectonDickinson (США)), Anti-MouseIg HRP DetectionKit (кат. 551011, BectonDickinson (США)). 10% желатин довести до жидкого состояния на слабом огне. Полученный раствор поместить в теплоизоляционную посуду. костный мозг соединяем с растворенным желатином в соотношении 1:1. В полученную смесь добавляется 10% формалин в соотношении 1:10 и осторожно перемешиваем. таким образом, концентрация формалина в смеси костного мозга и желатина достигает около 0,8-1,0%. Все ставится в холодильник при t 2-40С для застывания на 30-60 мин. Из полученного застывшего материала нарезались блоки, из которых на замораживающем микротоме получали срезы толщиной 4-6 мкм. Срезы помещались на предметные стекла, обработанные полилизином (ThermoScientific). для гистологического исследования производили окрашивание гематоксилин – эозином. При иммуногистохимическом исследовании срезы обрабатывались Retrievagen A (pH 6.0) (кат. 550524, BectonDickinson (США)) для демаскировки антигена согласно протоколу производителя. Антитела CD34 разводилиAntibodyDiluentfor IHC (кат. 559148, BectonDickinson (СШа)) в соотношении 1:10 и наносили на срезы согласно инструкции производителя. Затем срезы обрабатывали системой визуализации с детекцией ДАБ Anti-MouseIg HRP DetectionKit (кат. 551011, BectonDickinson (США)), докрашивали гематоксилином и накрывали покровным стеклом. Далее гистологические препараты визуализировались на оптическом микроскопе Olympus CX 41 (Япония). Результаты: сокращается время приготовления гистологических блоков и срезов. Сохраняется прижизненная фиксация состояние клеток и тканей, за счет применения 0,8-1,0% формалина; исключаются более дорогостоящие уплотнители (парафин, целлоидин, специальный парафин для гистологических исследований, содержащий различные пластические полимеры) и другие расходные материалы при проводке блоков и срезов; модификация позволяет приготовить не менее качественные гистологические препараты, получаемы при других методиках. Заключение: данная модификация получения гистологических срезов костного мозга, имеет ряд преимуществ и может быть использована в научных исследованиях, а также в гистологической, патогистологической практике и позволит более полно изучить прижизненно костный мозг трубчатых костей.