Исследование степени пролиферации лимфоцитов и экспрессии мРНК генов ИЛ2 и ИЛ2РА в активированных конканавалином А лимфоцитах с помощью ПЦР «в реальном времени»

Abstract

One of the traditional methods of lymphocytes functional activity research is blast transformation reaction (RBTL). The rate of PBMC proliferation in response to different stimuli can be evaluated in vitro by introduction of radioactive 3H-thymidine in cell DNA. The aim of our work was to search for alternative method of RBTL evaluation by PCR since clinical application of RBTL is limited due to radioactive labelling. The genes expressing an increased proteomic activity of their products in mitosis such as topoisomerase II alpha (gene tpa) and CDC2 (gene cdc2) were chosen as proliferation markers. In our work test systems for mRNA content estimation of tpa and cdc2 genes in concanavalin A activated lymphocytes were developed by means of real time PCR. Kinetics of mRNA level of il2 and il2ra genes in these cells was investigated. As a result the mRNA accumulation of the given genes was monitored from the stimulation starting up to 180 hours of post stimulation time. Common pattern of their mRNA expression in cells of healthy donors was identified, significant differences in kinetics of mRNA levels in comparison with lymphocytes stimulated by phytohemagglutinin were determined.The obtained results show that tpa and cdc2 mRNA are reliable proliferation markers in RBTL. Thus convenient test systems for lymphocytes functional activity evaluation in vitro free of radioactive labelling can be developed. The mRNA level of interleukin 2 gene can be used as marker of lymphocyte activation by concanavalin A in the first hours of stimulation.

Реакция бластной транформации лимфоцитов (РБТЛ) представляет собой классический метод исследования функциональной активности лимфоцитов. В зтой реакции in vitro оценивают степень пролиферации мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) в ответ на различные стимулы с помощью включения меченого 3Н-тимидина в ДНК в сравнении с нестимулированными клетками, однако использование радиоактивной метки ограничивает применение этой методики на практике. Целью работы являлось исследование степени пролиферации мононуклеарных клеток периферической крови с помощью разработанной нами тест-системы на основе ПЦР «в реальном времени» в сравнении с классической методикой с использованием 3Н-тимидина. Маркерами реакции служили гены, активность продуктов которых возрастает при митозе: топоизомеразы II альфа (ген tpa) и белка CDC2 (ген cdc2). В ходе работы с использованием метода ПЦР в режиме «реального времени» была исследована кинетика накопления соответствующих мРНК в процессе стимуляции мононуклеарных клеток периферической крови неспецифическим митогеном конканавалином А (СопА). Также был проведен мониторинг изменения уровня мРНК генов интерлейкина 2 и рецептора интерлейкина 2a(il2 и il2ra, соответственно). Выявлены значимые различия в кинетике накопления мРНК исследованных генов по сравнению со стимуляцией фитогемагглютинином.Полученные результаты показывают, что мРНК генов tpa и cdc2 может служить надежным маркером пролиферации клеток в РБТЛ, что позволяет создать удобные тест-системы для оценки функциональной активности лимфоцитов in vitro без использования радиоактивной метки, а определение уровня мРНК интерлейкина 2 можно использовать как маркер активации клеток иммунной системы при стимуляции СопА в первые же часы после стимуляции.